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[生物与医学]

伤口愈合实验--神经生长因子(NGF)和神经生长因子前体(proNGF)会激活乳腺癌干细...

jj8879576 发表于 2016-7-12 15:16 |查看: 64482|回复: 16|显示全部楼层 |阅读模式
伤口愈合实验是体外研究细胞迁移的的一个有用的实验。原理是人为的在铺板的单层细胞中制造一个空白的无细胞的地带,然后对这个无细胞地带的边缘的细胞进行观察;这些边缘的细胞会开始进行迁移活动,并且最终覆盖整个无细胞的区域,重新互相接触在一起。法国的科研人员在2015年的 STEM CELL上发的文章中提出神经生长因子(NGF)和神经生长因子前体(proNGF)会自动的激活乳腺癌干细胞,并且发生侵袭。文中,使用乳腺癌细胞系和肿瘤分离的细胞进行伤口愈合实验,得出,由NGF处理的肿瘤离的乳腺癌细胞的伤口愈合速率有非常显著的提高。说明在NGF能促进乳腺癌细胞迁移活动。

Nerve Growth Factor and proNGF Simultaneously Promote Symmetric Self-Renewal, Quiescence, and Epithelial to Mesenchymal Transition to Enlarge the Breast Cancer Stem Cell Compartment
E. Tomellini, Y. Touil, C. Lagadec, S. Julien, P. Ostyn, N. Ziental-Gelus, S. Meignan, J. Lengrand, E. Adriaenssens, R. Polakowska and X. Le Bourhis
STEM CELLS, 2015, 10.1002/stem.1849

在文中,使用Ibidi开发的伤口愈合插件进行了伤口愈合实验。这是一种双孔的硅胶插件,可以放在培养皿中,插件两孔间的孔壁宽度为500μm。将细胞种在插件中,等待细胞贴壁长满后,将插件移除,这样,两孔间的缝隙就是一个无细胞的“划痕”。


一.实验材料
1)细胞:     MCF-7 、肿瘤分离细胞
2)实验耗材:   伤口愈合插件培养皿 (ibidi, 81176)
3)细胞培养基:  MEM medium
4)试剂:  EGF  (sigma, E9644)
           bFGF (R&D,233-FB)
           NGF  (Scil Protein)
           proNGF (Alomone Labs,N-285)
5)灭菌镊子

二.实验步骤
1.铺细胞(图三)
●将ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。
●在ibidi细胞插件的每孔中加入1 × 104的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。
●在37。C培养箱中孵育24小时。


图三:A. 去除培养皿底部的保护胶带。B.C.在ibidi伤口愈合插件中加入细胞。

2.形成“划痕”
●采用无血清MEM培养基培养细胞4小时
●如图四所示,小心的用镊子夹住插件的一个角,将插件移除。
           
●移除插件后,要用显微镜检查是否形成合格的“划痕”。
●小心的清洗细胞,之后加入2ml培养基进行培养(图五)。


3.采集并分析图像
●在显微镜下选取能同时看到“划痕”和两边细胞的视野进行成像,“划痕”的方向最好是水平或者垂直。
●采集0h和4h的图像,并且分析每张图的细胞覆盖划痕区的面积。


(三)实验结果


如图所示,ML表示MCF-7 细胞系。肿瘤分离细胞团分别由EGF、bFGF、NGF和proNGF处理,由t-EGF/bFGF、t-NGF、t-proNGF表示。可以看到由NGF处理的细胞,在4h的时候覆盖面积最大,迁移速率最快。

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lx474996518 发表于 2016-9-29 02:30 显示全部楼层
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cludyh 发表于 2016-9-29 06:44 显示全部楼层
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gdtz@tom.com 发表于 2016-9-29 09:31 显示全部楼层
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doudou 发表于 2016-9-29 10:30 显示全部楼层
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gxrshoulderknee 发表于 2016-9-29 11:34 显示全部楼层
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常佳乐 发表于 2016-9-29 14:08 显示全部楼层
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pengye 发表于 2016-9-29 15:34 显示全部楼层
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little薄荷 发表于 2016-9-29 15:53 显示全部楼层
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