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[分子生物]

细胞转染的操作方法

中洪博元 发表于 2016-7-15 18:05 |查看: 84326|回复: 10|显示全部楼层 |阅读模式
  转染 ,是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入,转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
    理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术,是目前转染效率最高的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特点。
需要指出的一点,无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态,到转染方法的操作细节,都需要考虑。

一、细胞传代
1. 试验准备:200ul/1mlTip 头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。
2. 弃掉培养皿中的培养基,用 1ml 的 PBS 溶液洗涤两次。
3. 用 Tip 头加入 1ml Trypsin 液,消化 1 分钟(37℃,5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
4. 加入 1ml 的含血清培养基终止反应。
5. 用 Tip 头多次吹吸,使细胞完全分散开。
6. 将培养液装入离心管中,1000rpm 离心 5min。
7. 用培养液重悬细胞,细胞计数后选择 0.8X106 个细胞加入一个 35mm 培养皿。
8. 将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培养皿中,使其均匀分布。
9. 将培养皿转入 CO2培养箱中培养,第二天转染。

二、细胞转染
1. 转染试剂的准备。
① 将 400ul 去核酸酶水加入管中,震荡 10 秒钟,溶解脂状物。
② 震荡后将试剂放在-20 摄氏度保存,使用前还需震荡。
2. 选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA 质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的 MyoD 或者 EGFP 的 DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。
3. 将混合液在室温放置 10―15 分钟。
4. 吸去培养板中的培养基,用 PBS 或者无血清培养基清洗一次。
5. 加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。
6. 到时后,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养 24-48 小时。

三、第二次细胞传代
1. 在转染后 24 小时,观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。
2. 再次进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度 0.8X105 个细胞/35mm 培养皿将细胞重新转入
培养皿中。
3. 在正常条件下培养 24 小时后按照染色要求条件固定。

yellowgirl21 发表于 2016-9-29 01:14 显示全部楼层
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荷叶碧兰 发表于 2016-9-29 05:12 显示全部楼层
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little薄荷 发表于 2016-9-29 09:59 显示全部楼层
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gongjiji 发表于 2016-9-29 14:29 显示全部楼层
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聂雄小木虫认证 发表于 2016-9-29 16:31 显示全部楼层
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丹丹aimuchong 发表于 2016-9-29 16:56 显示全部楼层
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艾薇儿 发表于 2016-9-29 20:58 显示全部楼层
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20068851 发表于 2016-9-29 21:24 显示全部楼层
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蝶水琪 发表于 2016-9-29 22:31 显示全部楼层
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