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[农林]

芽孢杆菌拮抗产物分离纯化鉴定

不懂你就问 发表于 2017-12-25 19:43 |查看: 66519|回复: 5|显示全部楼层 |阅读模式
最近在做芽孢杆菌脂肽类抗生素物质的鉴定,但HPLC和LC-MS结果显示粗提物所含杂质太多,恳请大神指导一下该如何对其进行分离纯化
一只虫子实名认证 发表于 2017-12-26 11:55 显示全部楼层
芽孢杆菌能产生芽孢,在沸水中加热不 会失去生理活性,但是不能产生芽孢的细 菌会失去活性,因而得到芽孢菌属,经过 进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽 孢杆菌。
分离步骤
(1)土样的采集:取土壤表层5-10cm下的 肥土100g左右,把采得的土壤放入纸袋带 回实验室分离。
(2)平板的制备:溶化三角瓶中的牛肉汤 蛋白胨培养基,以每皿20ml左右倒6个平板。
(3)稀释分离法:称取土壤5g放入含有 45ml水的三角瓶中,摇动片刻,然后将此 瓶用小火加热至悬浊液沸腾,维持15min。 而后静止5min,吸取上层液0.1ml加入到含 有4.5ml无菌水的试管中,制成1:100浓度的 悬液,然后吸取土壤悬浊液0.2ml滴加到牛 肉膏蛋白胨培养基平板上,用涂布棒均匀 涂布,并将培养基倒置于37℃恒温培养1-2 天。  
(4)挑菌及纯化:从上述分离的平板上分 别挑取单菌落中部分菌体,在牛肉膏蛋白 胨培养基上划线纯化。(菌体应呈杆状, 具芽孢,宽度一致;菌落颜色、形状、质 地、透明度等均一致) 生理生化鉴定 ? 一 过氧化氢酶测定 将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上, 培养1—2天。取一载玻片,在上面加一滴 3—10%的过氧化氢,挑取一环菌苔,在过 氧化氢溶液中涂抹,若有气泡(氧气)出 现为阳性,无气泡者为阴性。
二 需氧性试验 ? 原理:不同种类的芽孢杆菌对氧气的需求 性常有差异,因此本实验可作为鉴定芽孢 杆菌的一个较重要指标。
操作步骤:菌液穿刺接种到上述培养基中, 一般于培养3—7天观察结果。若芽孢杆菌 在琼脂柱表面生长为好氧菌,沿着穿刺线 上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌
乙酰甲基甲醇实验
原理:有些芽孢杆菌发酵葡萄糖产酸,并将产生的酸进一步转化 为中性化合物,如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境中可 被氧气成二乙酰,后者与蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用,生 成红色化合物,即表示试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸以 补充胍基,可加速反应。 培养基:蛋白胨5g,葡萄糖5g,NaCl 5g,蒸馏水 1000ml。调节 PH 6.5,每管分装4—5ml,0.06MPa(8lbf/in2)30min灭菌 步骤: 将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中,一般于30摄氏度培 养4天,取培养液(约2ml)和等量的40%NAOH相混合,加少量 肌酸(约0.5—1mg),充分振荡,2—5min后如培养液呈红色, 即为试验阳性。 ? ? ? ? 四 淀粉水解 原理:许多芽孢杆菌产生淀粉酶,能将培养基中的淀 粉水解,淀粉水解后,遇碘不再变蓝色。 培养基:在肉汤琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉,分装 于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min灭菌备用。 步骤: 将培养基做成平板,凝固后取菌种点种于平板上 (每皿点种2点),一般于30摄氏度培养2—4天,形 成菌落后,在平板上滴加碘液,以铺满菌落为度,平 板呈蓝色,而菌落周围如有无色透明圈出现,说明淀 粉被水解,透明圈的大小,可表明水解能力的大小。 ? 经生理生化鉴定,确定是芽孢杆菌属纯 种后,从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨 斜面上,置37℃培养1-2天后备用 发酵条件的优化 ? 将纯化的菌种转接至LB平板上,37℃培 养24h,用接种环取活化菌种,接种于 100mlLB液体培养基,30℃、200r/min培养 24h作为种子菌。 ? 发酵过程中采用单因素试验方法,考察 不同培养温度(26、28、30、32、34、 36℃)、培养时间(26、32、38、44、50、 80h)、接种量 (1%、2%、3%、5%、10%)、 初始pH值(5、6、7、8、9)、培养基(Landy 培养基、Landy修饰培养基Ⅰ、 Landy修饰 培养基Ⅱ、LB培养基、无机盐培养基)对脂 肽类抗生素产量的影响。
结果表明,最佳培养条件为Landy培养基, 初始pH7· 0,接种量3%,发酵培养温度30℃, 发酵时间38h。
脂肽类抗生素的提取——酸沉淀法
培养结束后,7000r/min离心10min,取上 清,加 HCl调节pH为5· 0、4· 5、4· 0、3· 5、 3· 0、2· 5、2· 0,7000r/min离心10min,收集沉 淀。将沉淀在60℃ 的烘箱中干燥18h,称重 即为脂肽类抗生素粗提物的干重。比较不 同pH条件下沉淀的干重,以确定完全沉淀脂 肽类抗生素所需的最佳pH值。 脂肽类抗生素的HPLC定量检测 ? 将脂肽类抗生素粗提物过Sephadex LH-20层析柱,每管收集液分别经真空干燥 后,加入0· 2ml乙醇溶解。对每管乙醇溶液进 行平板抑菌试验,试验真菌为油菜菌核病菌, 将具有抑菌活性的收集液合并在一起,用离 心浓缩仪浓缩至完全干燥,即为脂肽类抗生素的干重。
gengying1964 发表于 2018-6-21 17:42 显示全部楼层
楼主,这是您写的吗?
张树山 发表于 2018-6-21 17:42 显示全部楼层
谢谢您的分享!以后多多分享一些这样的内容。
小虫木头 发表于 2018-6-21 17:43 显示全部楼层
这篇文章不错,我可以收藏吗,楼主大人
nancy_123 发表于 2018-6-21 17:43 显示全部楼层
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