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小木虫 小木虫快讯 生物 科研入门之手把手教你做细胞免疫荧光

科研入门之手把手教你做细胞免疫荧光

2016-12-2 11:00| 发布者:

摘要:   小编最近在做细胞免疫荧光实验,也是磕磕碰碰遇到了好多问题,参考了网上相关资料,再结合自身实际情况,现在总结出如下简单明了的实验protocol,分享给大家。  首先讲一下原理:免疫荧光技术(Immunofluoresc ...

  小编最近在做细胞免疫荧光实验,也是磕磕碰碰遇到了好多问题,参考了网上相关资料,再结合自身实际情况,现在总结出如下简单明了的实验protocol,分享给大家。

  首先讲一下原理:免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术,将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

  正式进入操作步骤:
  1.细胞铺板:将细胞以合适的密度(注意:一般情况下,细胞密度不要太高,不要叠在一起,否则干扰最后拍片)接种于玻底培养皿(b小编用的是confocal皿:如下图)中,进行转染,加药诱导等实验处理。

  2.固定:吸去培养基,PBS清洗2次。3min/次。加4%的多聚甲醛(用1X的PBS稀释配制),室温固定20-30min。PBS清洗3次,3-5min/次。吸干PBS。
  3.通透:加0.3%-0.5%Triton X-100(用1X的PBS稀释配制),室温通透20-30min(如果是检测细胞膜上表达的抗原,则省略此步骤)。PBS清洗3次,3-5min/次。吸干PBS。
  4.封闭:在玻底培养皿中滴加正常血清或5%BSA封闭液,室温封闭30-60min;
  5.孵育一抗:吸掉封闭液,不用PBS洗,在每个玻底培养皿中滴加足够量的稀释好的一抗,并放入湿盒,4℃孵育过夜;
  注意:一般抗体稀释比约为1:50-1:100。正常玻底皿培养皿每皿加50-100ml抗体稀释液(至少要能恰好浸没住底部细胞)。还有必须保证湿盒有水,以免干片。一抗建议回收,放-20℃或-80℃保存。若是检测多个指标,所用一抗必须是不同来源。
  6.孵育二抗:回收一抗,加0.1%的PBST 清洗3次,3-5min/次。吸干PBST。滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中20-37℃孵育1h,PBST浸洗3次,每次3min。
  注意:该步骤及之后步骤都需要避光操作。二抗稀释倍数约为1:100-1:200。
  7.复染核:滴加DAPI或Hochest孵育5-10min(避光操作),对样品进行染核,PBST 浸洗4次,每次5min。
  8.拍片:在共聚焦显微镜或荧光显微镜下观察采集图像。
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