找回密码
 注册新帐号

QQ登录

只需一步,快速开始

[生物与医学]

慢病毒生产方案

中洪博元 发表于 2016-7-21 15:10  
查看: 100594|回复: 19|显示全部楼层 |阅读模式
一、材料和试剂
1.  Hairpin-pLKO.1vector(OpenBiosystems)

2.  Packagingvectors:第二代包装质粒包含gag,pol,和rev基因(pCMV-dR8.91或pCMV-dR8.74psPAX2)和包被质粒(pMD2.G)(Addgene)

3.  脂质体2000(Invitrogen)

4.OptiMEM无血清培养基(Invitrogen)

5.  293T包装细胞(ATCC)

6.  DMEM(Invitrogen)

7.  胎牛血清(Invitrogen)

8.  青/链霉素(Invitrogen)

9.  6 cm 细胞培养皿(Fisher)

10.  45 um 过滤器(Fisher)

二、仪器
1.  细胞培养箱

2.  离心机


三、实验步骤
1.  6 cm 细胞培养皿中种植293T细胞,细胞密度为1.3~1.5×105,每孔体积6 ml。

2.  孵育细胞24 h(37℃,5%CO2),或者孵育至第二天下午。约24 h 后,细胞融合度应该达到了70%。

3.  转染包装细胞:
(1)准备含有3种转染质粒的混合物
900 ng 包装质粒
100 ng 包被质粒
1 ug pLKO.1质粒
10~30 ul OptiMEM培养基

(2)用OptiMEM稀释脂质体2000:10 ul 脂质体+90 ul OptiMEM。逐滴滴加脂质体试剂,通过颠倒旋转或者轻弹管子来混匀,(不能用移液器或者涡旋来混匀),室温下孵育5分钟。

(3)向稀释的脂质体中逐滴滴加上述3种质粒混合物,颠倒旋转或者轻弹管子混匀。

(4)室温下孵育转染混合物20~30分钟。

(5)小心将转染混合物移入包装细胞的培养液中。包装细胞对外源干扰非常敏感-小心不要让细胞从板上脱落。每板需要转染混合物的总体积为100~125 μL。

4.  孵育细胞18 h(37℃,5%CO2),或者直到第二天早上。

5.  更换培养液以去除转染试剂,为了进行病毒收获更替为6 mL 的收获培养液。

6.  孵育细胞24 h(37℃,5%CO2)。

7.  在转染约40 h 后收集含有慢病毒的培养液。将培养液移入储存管中。替换为6 mL 的收获培养液。

8.  每12~24 h 重复上述病毒收获过程,并且替换为6 mL 的收获培养液。病毒滴度在收获过程中会逐渐的减弱;通常总共收集2~3个时间点的病毒。最后一次收获之后,丢弃包装细胞。病毒收获物可以按需要进行合并。

9.  1250 rpm 的转速旋转包含病毒的培养液5分钟,使得在收获过程中所收集的包装细胞变成球状。将上清液通过45 um 过滤器,然后移入无菌储存管中。

10.  病毒在4℃可以保存时间较短(数小时到数天),但是在-20℃或在-80℃可以冻存较长时间。为了减少冻结/解冻的次数,在长期储存之前,需将大量的病毒产品分装入小的储存管中。
       中洪博元生物技术有限公司。因为专注,所以专业。

cristy5201 发表于 2016-9-29 07:01   显示全部楼层
谢谢您的分享!
yellowgirl21 发表于 2016-9-29 08:25   显示全部楼层
论坛有你更精彩!
dengmxgz 发表于 2016-9-29 09:03   显示全部楼层
谢谢您的分享!
熙娅2014 发表于 2016-9-29 09:22   显示全部楼层
大家都不容易!
feiyang 发表于 2016-9-29 09:49   显示全部楼层
以后多分享一些这样的有价值的帖子啊
gxrshoulderknee 发表于 2016-9-29 09:51   显示全部楼层
谢谢您的分享!
陆仁炳 发表于 2016-9-29 10:22   显示全部楼层
大家都不容易!
limingx 发表于 2016-9-29 10:51   显示全部楼层
好东西一定要看看!
王海峰 发表于 2016-9-29 14:20   显示全部楼层
以后多分享一些这样的有价值的帖子啊
您需要登录后才可以回帖 登录 | 注册新帐号

本版积分规则  | 请遵守小木虫学术科研第一站管理条例,不得违反国家法律法规

Copyright 2014-2018 小木虫学术科研第一站(xmuchong.com)All Rights Reserved.

公安备案:津公网安备 12011102000110号

      

ICP备案/许可证号:津ICP备14003772号-3

      

跟帖评论自律管理承诺书

      

统一社会信用代码:911201110731367936