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[分子生物]

医学实验外包/探针的标记

中洪博元 发表于 2016-7-26 14:48  
查看: 96134|回复: 13|显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 一只虫子 于 2016-7-27 09:36 编辑

      深圳中洪博元生物技术有限公司     因为专注,所以专业。

  在RNA原位杂交中,不仅要选择适当的探针,而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法有酶反应法和化学反应法。

1.  酶反应法:用于RNA探针的酶反应法主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5'端或3'端的一种标记法,末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记,用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。

2.  体外转录法:体外转录法是一种制备与克隆片段序列相同的单链RNA探针的方法。进行体外转录时,先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中,然后在RNA聚合酶的作用下,以DNA为模板,以含有标记的三磷酸苷为原料,对启动子下游的序列进行转录,而启动子本身并不被转录。体外转录常用噬菌体转录启动子,如沙门氏菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体T3,T7。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点的两侧,用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。SP6噬菌体的RNA聚合酶对SP6启动子序列具有高度的亲和性,从而启动下游的转录,在4种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体RNA聚合酶存在的条件下,即转录成RNA。如反应物中含有标记的三磷酸核糖核苷,所有的RNA就被标记。

依标记物为同位素和非同位素,近年来非同位素标记探针已有了极大的近步。常用非同位素标记技术有生物素,地高辛,碱性磷酸酶,辣根过氧化酶和荧光素。非同位素标记法又可分为直接标记法和间接标记法。直接标记法是将标记物直接结合到探针上,当探针与组织内相应靶核苷酸结合后,即可显色观察。这类标记探针必须符合标记物在杂交过程中不丢失,又不影响杂交反应为条件。大量已发表的文献表明,由于检出杂交信号受到多种因素制抑,只能限于靶RNA丰富的细胞或组织中,RNA杂交对低拷贝的基因检测不理想。近年来间接标记法得到较快发展,先将标记物结合在探针上,通过特异性抗体识别,由特异性抗体结合多种酶,对检测的杂交信号作有放大,这一类标记法已展示极好的发展前景。



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原来如此 发表于 2016-9-29 02:02   显示全部楼层
谢谢您的分享!
cristy5201 发表于 2016-9-29 11:31   显示全部楼层
好东西一定要看看!
cappuccino 发表于 2016-9-29 14:53   显示全部楼层
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1084268272 发表于 2016-9-29 15:51   显示全部楼层
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gdtz@tom.com 发表于 2016-9-29 18:45   显示全部楼层
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龚颖~~ 发表于 2016-9-29 20:48   显示全部楼层
谢谢您的分享!
招财喵了个咪 发表于 2016-9-29 21:16   显示全部楼层
大家都不容易!
limingx 发表于 2016-9-29 21:46   显示全部楼层
谢谢您的分享!
你好岁月 发表于 2016-9-29 23:42   显示全部楼层
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