慢病毒载体介导红色荧光蛋白基因转染人脑胶质瘤干细胞

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[生物与医学]

慢病毒载体介导红色荧光蛋白基因转染人脑胶质瘤干细胞

中洪博元 发表于 2016-8-2 16:31  
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本帖最后由 一只虫子 于 2016-8-2 17:29 编辑

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红色荧光蛋白(red florescence protein,RFP)是细胞研究的常用蛋白标记,是细胞生物学示踪研究中的重要标记物,荧光显微镜下可被直接观察,因此被广泛用于肿瘤的生长、浸润及血管发生等追踪性研究[。质粒转染和病毒转染是将RFP 转染到细胞内的常用方法。慢病毒作为一种较新的病毒载体,具有转染能力强、毒性小、目的基因表达稳定等优点。

通过含有红色荧光蛋白基因的慢病毒(Lentivirus)转染人脑胶质瘤干细胞,以探讨慢病毒载体介导RFP 基因转染标记人脑胶质瘤干细胞的转染有效性,为胶质瘤干细胞的实验研究和示踪,提供一种有效的病毒转染方法,为胶质瘤干细胞的研究提供基础。

1 材料与方法
1.1 实验材料和仪器
人脑胶质瘤干细胞、红色荧光蛋白基因的慢病毒(RFP-Lentivirus);CD133,Nestin 兔抗人,FITC、Cy3 免疫荧光试剂盒;DMEM/F-12,N2 添加剂,BFGF,EGF 因子;荧光显微镜,倒置显微镜;CO2 培养箱。

动物实验外包  

1.2 方法
(1)脑胶质瘤干细胞的培养与传代,鉴定
将人脑胶质瘤干细胞SU2 反复吹打成单细胞悬液,接种于无血清干细胞培养基(含DMEM/F12,EGF 20ng/ml,bFGF 20ng/ml,1/100N2)培养瓶中,置于37℃,5%CO2 培养箱。每天观察细胞生长状态,于显微镜下观察、摄片,并连续培养传代。然后取生长良好的未转染RFP 的悬浮球体行CD133、Nestin 免疫荧光染色。

(2)慢病毒转染胶质瘤干细胞
将球状干细胞用0.02% 胰酶消化后反复吹打成单细胞悬液,稀释胶质瘤干细胞计数1000~100000 个转移至24 孔板,每孔设2~3 个复孔。每孔加400μl 培养基,待细胞生长良好、细胞密度达30%~40%,每孔加1~2μl 带红色荧光病毒颗粒,轻轻混匀,病毒量不宜过高。8h 左右离心后弃培养基,换上新鲜培养基。2~3d 后在荧光显微镜下观察红色荧光表达情况。

(3)转染率
检测 将生长良好的转染后的胶质瘤干细胞连续多次体外传代,用胰酶制成单细胞悬液,PBS 反复冲洗,在200 倍荧光显微镜[激发波长488nm、发射波长(530±15)nm]下进行RFP 阳性细胞计数。每个样本计数10 个视野,每个视野计数100 个细胞。计算RFP 阳性细胞的转染率。转染率=RFP 阳性细胞数/ 细胞总数×100%。

(4)生长曲线绘制
将球状SU2 和RFP-SU2 经0.02 %胰酶消化并离心后加人DMEM/F12 培养液制成单细胞悬液并行细胞计数。将两组细胞分别分成9孔,每孔设置3 个副孔,细胞以5×103 /孔接种于96 孔板,置于37℃、5% CO2 条件下培养。分别于培养的24h、2d、3d、4d、5d、6d、7d 进行检测,每孔加入5mg/ml MTT 溶液20μl,37℃、5%CO2 的条件下孵育4h 后终止培养。小心吸净上清液,加入二甲基亚砜(DMSO)100μl,平板床振荡10min。在酶联免疫检测仪上测定细胞的吸光度(OD)值,所用实验波长为490nm。将RFPSU2组与未进行RFP 转染的单纯SU2 生长对照组于转染后每日按上述步骤进行MTT 检测。以时间为横轴,OD 值为纵轴, 绘制两组细胞的生长曲线。
(5)慢病毒转染后脑胶质瘤干细胞的免疫荧光染色
取经多次体外连续传代培养慢病毒转染后的脑胶质瘤干细胞(RFP-SU2)行CD133、Nestin 免疫荧光染色。具体步骤:将RFP-SU2 种植到经多聚赖氨酸处理的玻片上,56℃温箱中烘干,PBS 洗3 次,4% 多聚甲醛室温固定20min,PBS 洗2 次,0.1% Triton-X100 孵育10min,PBS 洗2 次;1%BSA封闭,室温孵育1h,PBS 洗2 次;分别加入适量以封闭液稀释的第一抗体CD133、Nestin,4℃孵育过夜;PBS 洗3 次,加入FITC(两种抗体只能加FITC,因为转染后的干细胞表达红色荧光蛋白)耦联的二抗,室温避光孵育2h ;PBS 洗3 次,以50%、70%、95% 和100% 四个浓度梯度的乙醇梯度脱水,甘油封片,取出盖玻片,覆盖在载玻片上,自然晾干,于荧光显微镜下观察,摄片。

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Jo双 发表于 2016-9-29 03:03   显示全部楼层
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THINKER 发表于 2016-9-29 09:55   显示全部楼层
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shj 发表于 2016-9-29 10:27   显示全部楼层
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醉仙翁 发表于 2016-9-29 10:58   显示全部楼层
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昆虫记个人认证 发表于 2016-9-29 18:45   显示全部楼层
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玫瑰之泪 发表于 2016-9-29 22:02   显示全部楼层
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xiaojuan 发表于 2016-9-30 09:38   显示全部楼层
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20068851 发表于 2016-9-30 10:13   显示全部楼层
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聂雄个人认证 发表于 2016-9-30 10:27   显示全部楼层
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