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[分子生物]

蛋白研究系列专题10-WB检测之抗体,您选对了吗?

梦见宾 发表于 2017-4-1 10:57  
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本帖最后由 梦见宾 于 2017-4-1 17:21 编辑

WB免疫印迹法,也称免疫转移技术IBT(Immunoblotting),是Towbin将1975年Southern发明的Soutnernblotting技术应用于蛋白-蛋白相互作用建立的免疫学检测方法。其操作简便,主要用于未知蛋白检测及抗原组分、抗原决定簇鉴定,同时也用于未知抗体的检测和单抗鉴定等,在生物学基础研究和临床疾病早期诊断和预后跟踪分析方面都有应用。WB检测的基本原理不做细述,可根据以下图片脑补一下:

WB实验中使用到的有三种抗体:一抗、二抗和内参抗体。一抗是唯一针对目标抗原的抗体,可以进行制备也可以购买现货,难度系数较高;二抗直接买就OK,只是需要留意下种属选择;内参抗体必不可少,是WB实验中的质控环节。

那么,宝宝们在制备抗体或者选择抗体时,是不是十分纠结?今天,小编跟大家聊聊。
WB检测之一抗
一抗制备
如果目的蛋白的现货抗体没有找到,或者都不中意,就需要亲自动手制备了,请公司帮你做也不错哦!自己制备一抗通常情况下可以选小鼠、兔制备多抗或者选小鼠制备单抗,前者省时省钱,后者耗时耗财却各有优缺点。多抗制备出来容易产生杂带,却容易出结果,单抗制备出来能得到单一条带及一张漂亮的WB图片,拿去炫耀下也不错。然而做单抗如果没有强有力的细胞培养、融合、筛选经验,也有各种意想不到的结果。比如完败,或者只筛到一株却不能做WB。不过在每一步实验中注意细节还是可以得到满意的抗体的。

多抗制备过程:
第一步:免疫及效价检测。看似只是把抗原打进动物体内,其实暗藏玄机,不同的免疫方式效果不一。通常情况下,免疫效果排序如下:皮内>皮下>腹腔>静脉,通常采用皮内或皮下免疫。免疫剂量过多过少均会产生免疫耐受,一般小鼠每次每只免疫50 μg共4次,兔每次每只免疫300-500 μg共5次。每次免疫后测定效价均要设置对照,以排除各种情况导致的ELISA假阳性或假阴性。
第二步:取血。小鼠取血通常采用眼球取血,一只小鼠可得到大约1.5 mL的抗血清。兔取血通常采用颈动脉取血,一只兔可得到大约25 mL的抗血清。
第三步:抗体纯化。单抗的纯化使用proteinA/G即可,得到的都是均一性的抗体分子。多抗的纯化可以采用proteinA/G或抗原亲和纯化,后者筛掉了一些非特异性的IgG,留下的都是能与抗原结合的抗体,所以能在一定程度上避免WB结果的杂带问题。

单抗制备过程:
第一步:参照多抗制备的第一步。
第二步:细胞融合。细胞在融合的过程中非常脆弱,所以劲道要轻、时间要把控好,一般按照标准的融合方案来,做到能一手画圆一手画圈,此步需要向郭靖童鞋学习,手不要抖则基本达标,可以在融合板里看到很多圆溜溜的单克隆。
第三步:亚克隆。基本上程序化操作,对细胞吹打不要太狠就行。
第四步:筛选检测。细胞融合及亚克隆后都要对细胞上清进行筛选检测。细胞单克隆在生长过程中容易因为外力散落成不规则形状而影响判断,或许一个很好的阳性克隆就这么被忽略掉了。所以千万不要让你的板子磕到了,尤其是融合的细胞板换液时更是要极其小心。当然,如果不嫌麻烦可以把融合板的单克隆挑到新的细胞板再进行检测。
第五步:腹水制备。将筛选的阳性单抗细胞株注射到小鼠腹腔,经过一段时间小鼠腹腔会产生含高浓度单抗的腹水。注射的细胞数量不宜过多或过少,过少会导致不生成腹水或周期过长,过多会导致小鼠过早死亡。一般一只小鼠腹腔注射10^6个细胞即可,大约2周即可取腹水。
第六步:参照多抗制备的第三步。
   
一抗选择
如果有现货,就不用花时间精力再去自己制备啦,快来get现货一抗选择新技能!
①抗体的说明书中明确指明可用于WB检测的是首选。但没写不表示不能做,可能厂商没有验证,如果确实需要这个或者只有这一个,可以向厂商申请试用装哦。
②抗体适用的种属也是需要考虑的。说明书中也会写明,如果研究样本的来源物种不在列表里,也并不代表就不能使用,不过最好不用。当然抗体的适用性与不同物种统一蛋白的序列相似性有关,用信息学的方法比对一下可以预测抗体是否可用,如果同源性较高的话还是可以选择的。
③抗原类型也需要审视。免疫原不限于蛋白,菌体或细胞都可以作为免疫原,在选择时要进行区分。比如要检测的是蛋白的区段或同型物,就要选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。
④如果一抗是未标记的,后续还需使用二抗,则选择的一抗来源物种与样本来源物种要避免相同导致交叉反应。比如检测大鼠组织内目的蛋白,则最好选兔抗鼠的一抗,而不选择小鼠来源的一抗。如果一抗是标记的,则可以不考虑这个问题。

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