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[分子生物]

蛋白研究系列专题12-ELISA方法

梦见宾 发表于 2017-4-7 11:31  
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酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)是研究蛋白抗体的重要方法。它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合,然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。那么,它与其它检测方法的灵敏度及您了解吗?跟着小编往下看!

  
检测方法           
  
灵敏度   
化学比色法         
mg/mL  
酶反应测定         
μg/mL   
凝胶扩散法/浊度法   
μg/mL   
酶联免疫法         
ng/mL   
酶联免疫法有这么优秀的性能,还有什么理由不赶紧学一学!
ELISA通常分为四种类型:直接法、间接法、竞争法、夹心法等,直接上图:
直接法(Direct ELISA仅需要抗原和酶标一抗,操作简便,可避免交叉反应,然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求,同时也并非所有的一抗适合标记处理。直接法在实际运用中并不多见,它并不能对样本中抗体进行定量分析,因为样本中抗体是非酶标抗体,无法进行后续显色,但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法,见后文。
间接法(Indirect ELISA使用了二抗增加信号强度,也使抗体的选择多样化,然而间接法容易产生交叉反应。间接法只能用于测定抗体,主要用于疾病的诊断,其优点是只需要改变包被抗原,酶标抗体是通用的。
夹心法(Sandwich ELISA分为双抗体夹心法和双抗原夹心法:
  双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体,结合于不同位点。捕捉抗体固定于载体上,检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗,而且对同一抗原结合位点不同,如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势,但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测,主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于双抗体夹心法特异性高,在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应(一步法),此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”,此时测出的结果将低于实际含量甚至是阴性结果(钩状效应hook ffect)。因此,如果使用一步法测定样本中抗原含量时要注意测量的线性范围,另外使用高亲和力的单抗也可削弱钩状效应。
  双抗原夹心法中抗原被包被于固相,检测样本中的抗体结合于抗原后,使用酶标的抗原进行结合及后续反应,可以用来测定样本中的抗体。双抗原夹心法的关键在于酶标抗原的制备,需要根据抗原结构进行设计,在医学检验上测定抗HBsAg抗体采用的就是此法,检测时被测样本不需要稀释即可直接进行测定,故此灵敏度相对而言高于间接法。
竞争法(Competitive ELISA是用样本中的游离抗体/抗原与固相的酶标抗体/抗原竞争性结合的分析方法。当游离抗体(或抗原)浓度越高,则能与固定抗原(或抗体)结合的酶标抗体(或抗原)就越少,后续显色就越浅,即与对照相比,显色越浅,表示检测样本中抗体(或抗原)含量越高。该法适合比较不纯的样本,且重复性好,但是检测的灵敏度和专一性较差。竞争法测抗体常常用于检测某些干扰物质不易去除的样本及难以纯化得到抗原等情况。竞争法测抗原常用于检测小分子抗原及半抗原,这类抗原通常缺乏两个以上的识别位点,不适用于双抗夹心法进行测定。
捕获包被法也称为反向间接法,主要用于测定血清中某类抗体亚型如IgM。为排除血清中IgG的干扰,用抗IgM抗体包被后用于捕捉样本中的IgM,然后加入特异性结合抗原进行后续检测。捕获包被法常用于对病毒性感染的早期诊断。在测定IgM的实验中常受到类风湿因子(RF,一种能结合多种动物IgG Fc的自身IgM抗体)的干扰,导致假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段制备酶标抗体可以消除RF的干扰,这一方法在双抗体夹心法中也具有同样的效用。
  除了这五种检测方法,新兴的ELISA检测技术不断被开发出来,例如基于细胞的ELISAcell-based ELISA,是将细胞接种于微孔板中取代原来的抗原,该方法可以对一些处理造成的实时动态的蛋白含量变化进行测定,无需裂解细胞,可减少目的蛋白的损失,而其缺点即不能对抗原进行定量分析。

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