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[分子生物]

蛋白研究系列专题13-ELISA的真真假假

梦见宾 发表于 2017-4-10 13:38  
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ELISA被广泛应用于农业、养殖业、食品安全、临床诊断等领域,是一种灵敏度高、特异性强、操作简便的检测方法。在实际应用中,ELISA操作的各方面均对结果产生影响,如移液器的使用、样本存放、加样、溶血、试剂温度、避光等。除此之外,一些非主观因素也会对结果造成较大偏差。
ELISA实验中的假阴性和假阳性结果,让各位实验君头都大了吧?欲哭无泪吧?今天,小编和各位一起分享下假阴性、假阳性的原因及解决办法。
假阴性
①标本用肝素或EDTA等抗凝处理,易造成HBsAg检测结果假阴性。肝素抗凝血浆会增加OD值,可能与高浓度肝素具有强大的负电荷,能吸附酶标记物不易洗脱有关。EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中的辣根过氧化物酶活性,造成假阴性。
           
                   肝素                          
②采用双抗体夹心法测定抗原时,如果用一步法测定,而此时被测物浓度过高,则可能由于勾状效应导致检测结果为阴性。为避免这种情况可以对样本进行稀释,或者直接改用双抗体夹心两步法。
         
   双抗体夹心法               
③样本内被测物的浓度较低,也易造成假阴性结果。比如某些疾病发展初期被检物浓度低于检测限。
④某些情况下,个别个体的基因突变也可能导致检测结果为假阴性。尤其是检测用抗体的结合位点在突变区的情况下,这种情况虽然极其罕见,但是也可能存在的。
假阳性
假阳性的出现通常是样本中掺杂有同源或同工物质,例如类风湿因子、补体、交叉反应物质和其它物质等。
           
类风湿因子               
①血液样本处理时,如有溶血会使样本中具有弱过氧化物酶活性的亚铁血红素催化底物四甲基联苯胺(TMB)显色,产生假阳性结果。因此,在处理ELISA最常检查的血清样本时,要注意凝集过程、离心过程等细节,避免出现溶血和掺杂血细胞。
②RF(一种能结合多种动物IgGFc的自身IgM抗体)可与酶标二抗Fc结合造成假阳性。为避免这种情况,在检测抗原时可加入2-巯基乙醇使RF降解,或用热变性IgG(63℃,10 min)进行封闭处理。另外,使用F(ab)2替代完整的IgG也可达到目的。一些其他的嗜靶抗原自身抗体,如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素球蛋白等在检测时,可能与靶抗原结合形成复合物,干扰测定结果。所以在测定前需用理化方法将其解离后再测定。
③补体一方面会使一抗和酶标二抗分子发生变构暴露出Fc段C1q分子结合位点,从而将二者连接起来造成假阳性。另一方面也可能会结合固相抗体从而封闭其与抗原的结合表位而造成假阴性。所以对细胞培养用血清、动物血清样本进行56 ℃ 30 min的补体灭活是有必要的。另外,通过用EDTA稀释样本也可降低这种作用。
               
       补体C1q                     
④样本中存在的类地高辛、类AFP等物质能与抗原产生交叉反应。尤其在使用单抗测定抗原时,如果正好交叉反应的抗原决定簇是单抗结合位点时,会出现假阳性结果。
               
          地高辛                        
⑤如样本中因实验处理或污染含有某些细菌,如表皮球菌,菌体释放的内源性HRP可能会对检测结果造成假阳性。
在ELISA检测中为了避免出现假阴性或假阳性,不仅要严格执行标准操作规程,还要对与标本相关的各因素进行分析,采用对应措施排除干扰物质的干扰作用,做到检测结果准确一致。

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 楼主| 梦见宾 发表于 2017-4-10 13:40   显示全部楼层
武汉金开瑞ELISA检测可以的。
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