【蛋白研究系列专题】-17丨分分钟get引物各纯化方式

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[分子生物]

【蛋白研究系列专题】-17丨分分钟get引物各纯化方式

梦见宾 发表于 2017-5-10 14:53  
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   如今,引物纯化方式多种多样。各位科研君,每天忙碌奔波于核酸提取、载体构建、蛋白表达等环节,没有深入了解过各种引物纯化方式吧!今天,小编带各位对各种引物纯化方式作下对比。各位科研君在以后的研究中,记得对号入座哦!
一般纯化方式
   目前,采用的主打的引物纯化方式是脱盐纯化。其只能纯化掉引物中的盐分,并不能去除含的小片段,价格较为便宜,能满足一般常规的应用。

1. C18柱:
   又称为简易反相柱,对DNA有特异性吸附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱。因此能有效地去除盐分,但不能有效去除比目的片段短的小片段。该方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
2. OPC纯化:
   采用寡核苷酸纯化柱 (Oligonucleotide Purification Cartridge,OPC)纯化,制品纯度保证80 ~ 90%。此级别制品可用作PCR引物、DNA测序引物、各种探针等。该级别只提供长度在35 mer以下的合成DNA制品。序列更长时,制品的纯度得不到保证。

3. HAP纯化方法
   HAP(High Affinity Purification)其原理是利用合成引物5'-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附,而不含DMT的短链DNA不被吸附,从而达到分离纯化的目的。制品纯度可达到80~90%,可以满足杂交探针、测序、常规PCR(不再做进一步克隆实验)等用途了。但是因为其专一性吸附 DMT 能力有限,不免仍然有短片段带入的可能,而且负载量小。特别是对长于39 碱基以上的片段纯化效果不好。此级别只提供长度在10-39mer以下的合成oligo DNA制品。序列更长时,制品的纯度得不到保证。

4. RPC纯化
   RPC纯化是通过反相净化滤芯 (Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化,纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较,RPC是一种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如 C18的硅胶,能够很好的吸附DNA,并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、 PCR及基因合成等。

5. TON纯化
   基于特异和反相层析法,从合成好的产物中去除失败序列,提供最终的目标序列。适于35个碱基以下的引物。毛细管电泳(Capillary Electrophoresis)纯度大于75%。

PAGE纯化方式
PAGE纯化价格适中,纯度较高,能满足大多数应用,尤其是长度大于50个碱基的长链引物。

1. 经典PAGE纯化:
   PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis),该方法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化基于尺寸和构象分离全长产物和失败序列,可以分离相差一个碱基的引物(120碱基以内),从而提供高纯度的引物。纯化后的DNA纯度大于90%,相比与其他纯化方法,PAGE纯化对长链Oligo DNA (大于50 mer)的纯化特别有效,制品纯度保证90 ~ 95%。如订购的DNA欲用作RT-PCR引物、各种探针,或用于PCR克隆测序、定点突变等,请选用PAGE纯化制品。

2. ULTRA PAGE纯化:
   理论上分析型PAGE变性电泳,可以区分引物之间一个碱基的差别。经过PAGE纯化的引物,特别是长引物要的量都比较高,上样量都是非常大,电泳时的条带往往比较宽,带与带之间有重叠,分辨率有所下降,电泳后割带回收目的引物时,导致割的条带有时可能比较宽,很难避免割到差别仅一个或几个碱基的引物。因此,将原有的PAGE纯化方式升级优化为现在的ULTRA PAGE纯化方式,即在PAGE纯化的同时配合质谱对DNA进行定性分析,以保证回收片段的正确性。

HPLC纯化方式
   价格最高,纯度也最好,适用于小于40个碱基的未修饰寡核苷酸,用于定点突变、克隆、蛋白结合凝胶迁移电泳分析、治疗用途。
HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。



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