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[分子生物]

基因编辑2017年典型论文

一只虫子小木虫认证明星 VIP会员认证 发表于 2017-12-12 12:02  
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一、基因编辑技术进展

1.CRISPR的对比优势

        精确度和特异度低,脱靶率较高。CRISPR是当前最为热门的基因编辑技术,CRISPR是依赖基因靶向的向导RNA来结合特定的序列,而ZFN则不同,它是由蛋白构成的。这些结构域蛋白经过优化,可提高精确度和特异性,适合临床基因编辑。2015年12月,美国FDA批准了Sangamo的B型血友病治疗方案(SB-FIX),是在患者肝脏细胞的白蛋白基因位点中插入治疗基因,采用的是ZFN技术平台,有着出色的特异性和极低的脱靶修饰水平,在基因组指定的位点获得80%以上的编辑效率,且脱靶效应低于检测限,这种能力正是治疗性的基因编辑所需要的。Sangamo的ZFN平台对基因组所做的修饰在遗传上是稳定的。

         简单、廉价、效率高。CRISPR设计简单,能轻松获得现成的CRISPR全基因组文库。此外,与ZFN和TALEN相比,它的切割效率提高,也增加了其在全基因组筛选和单个靶点编辑中的应用;CRISPR的另一方面的优势是其可用于静息细胞的基因编辑。未来CRISPR技术的进一步研究可逐渐克服其脱靶效应的出现。

2. 2017年基因编辑技术进展

(1)新一代CRISPR基因编辑工具CRISPR/Cpf1

CRISPR/Cpf1基因编辑系统出现于2015年,与CRISPR/Cas9基因编辑系统相比,新的CRISPR/Cpf1基因编辑系统具有如下优势,①只需一个协助RNA分子,Cas9需要2个RNA分子协助,Cpf1(也称作Cas12a)只需要一个RNA分子;②Cpf1酶分子量比Cas9小,进入细胞更容易,编辑成功率会提高;③Cpf1系统不同的识别序列令其基因编辑效果更好;④剪切位置与Cas9不同,选择余地更大;⑤产生黏性末端,便于新DNA序列插入。

1月份,Cell发表张锋关于第二类CRISPR-Cas系统CRISPR/Cpf1的综述,介绍了新一代CRISPR基因组编辑系统,基于不同的效应蛋白家族,可以分为3种类型和9种亚型,其中譬如Cas9和Cas12a(Cpf1)。指出Cpf1系统更简单一些,它只需要一条RNA。Cpf1酶也比标准SpCas9要小,使得它更易于传送至细胞和组织内;Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA。当Cas9复合物切割DNA时,它切割的是同一位点的两条链,留下的“平端”(blunt ends)在重新连接时往往会发生突变。采用Cpf1复合物生成的两条链切口是偏移的,在裸露端留下了短悬端(overhang)。这预计有助于精确插入,使得研究人员能够更有效及精确地整合一段DNA;Cpf1切口远离识别位点,这意味着即便在切割位点靶基因突变,仍然可以进行再度切割,提供了多次机会来校正编辑;Cpf1系统还为选择靶位点提供了新的灵活性(DOI:10.1016/j.cell.2016.12.038 )。

5月,NucleicAcids Res发表上海生科院在Cpf1蛋白切割机理方面的研究,鉴定了Cpf1蛋白的精确切割位点,并基于该切割特性开发新的DNA无缝拼接方法。Cpf1的切割位点方面,受到crRNA spacer序列长度的影响,当spacer序列长度大于等于20的时候,Cpf1倾向于切割非互补链的18位,而当spacer序列长度小于20的时候,Cpf1倾向于切割非互补链的14位。基于Cpf1在较短spacer长度的crRNA介导下,可以特异切割靶标DNA的14位与22位,形成8nt的长黏性末端的特性,结合Taq DNA连接酶高精度的连接特性,并将其开发为一个大DNA片段体外无缝编辑的新工具(DOI:10.1093/nar/gkx018)。

6月,Nature发表哥本哈根大学论文,从结构上揭示CRISPR-Cpf1的DNA靶向机制,阐述了Cpf1的分子剪刀让DNA解链并进行切割的分子机制,指出Cpf1的主要优势在于它的高度特异性和DNA切割方式,这是因为利用这种新的分子剪刀能够产生交错末端,而不是Cas9产生的平端断裂。这些交错末端有利于DNA序列插入(DOI:10.1038/nature22398)。

8月,NatBiotechnol发表张峰研究组扩展CRISPR/Cpf1 的靶点选择范围的研究,指出突变AsCpf1和LbCpf1的方法可以扩大了靶点选择范围,由靶点选择仅限于PAM为TTTV 的DNA序列扩大了PAM位点的选择范围(DOI: 10.1038/nbt.3900)。同月,Nat Chem Biol论文提出高效地编辑人类基因组的优化CRISPR-Cpf1技术,研究人员通过将导向RNAs和“复用”能力合并,改善了CRISPR-Cpf1基因编辑系统的作用效率,能够简单、明显改善同时对多个基因或单个基因多个位点的编辑能力,并指出Cas9和Cpf1是最常用的两种分子剪刀,来源于两种类型细菌的Cpf1分子能够更加精确地对哺乳动物细胞进行作用(DOI:10.1038/nchembio.2410)。

(2)不断提升基因编辑工具效率和准确率

测序辅助的基因编辑技术的发展。7月份,Nature Medicine发表Broad研究院发表关于减少由人体遗传变异导致CRISPR/Cas9基因编辑系统精度削弱的方法,研究提出利用全基因组测序对患者进行预筛查,然后结合此信息及以往的经验来选择向导RNA,可帮助研究人员设计出有效且安全的CRISPR疗法(Doi:10.1038/nm.4377)。

Cas9改进技术提升特异基因片段搜寻和剪切效率。9月份,Science论文改提出改进Cas9的PAM序列,改善Cas9打开DNA双螺旋以搜索基因的位置和频率,使得Cas9更加快速地发现它们的靶序列,而且也会降低副作用产生的风险(DOI:10.1126/science.aah7084)。

修正Cas9可大幅降低CRISPR-Cas9的脱靶效应。9月,Nature论文指出操纵Cas9的REC3结构域可大幅降低CRISPR-Cas9的脱靶效应  (DOI:10.1038/nature24268)。

高效CRISPR/Cas9编辑的基因组规则的发现。11月份,PNAS发表霍普金斯大学关于提高CRISPR/Cas9基因编辑效率的基因组规则,研究指出线性DNA片段作为供者DNA在人细胞中DNA编辑的效率比环状DNA(这里指质粒)高2~5倍;最佳的同源臂长度大约为35个核苷酸(35nt),远短于通常使用的的长度;供者DNA距离CRISPR/Cas9切割位点不到30nt时,编辑成功率达到最高(DOI:10.1073/pnas.1711979114)。本研究对于人类基因编辑效率的提升具有重要指导意义。

提升CRISPR/Cas9编辑准确性方法。11月份,Nat Commun提出一种新的方法可以使CRISPR基因编辑准确性高达98%,该方法采用RNA适配子(RNA aptamer)分子胶组装一种完整的CRISPR修复工具包并将这种工具包运送DNA切割位点上,从而精确地将重写DNA序列的概率提高了10倍,并且具有非病毒载体、更大的灵活性等特点(DOI:10.1038/s41467-017-01875-9)。

校正点突变的DNA/RNA碱基编辑器。11月份,Nature和Science发表新型DNA/RNA碱基编辑器论文,提出可校正点突变的基因工具,该研究进一步扩大了CRISPR的使用范围,开发出一种更加微妙的被称作碱基编辑(base editing)的方法来修复遗传物质。Nature论文扩展了一种编辑DNA的策略,而另一项研究通过对RNA进行碱基编辑而开辟了新的领域。将gRNA与失活的Cas9(dCas9)融合在一起,在dCas9不切割整个DNA双螺旋的同时解链DNA,产生碱基突变的效果。Science论文中张锋团队通过将gRNA与一种不同的没有切割活性的核酸酶dCas13和一种将RNA中的A转化为I的天然性酶融合在一起而构建出一种RNA碱基编辑器(DOI:10.1038/nature24644;DOI:10.1126/science.aaq0180)。

   更为安全的CRISPR基因编辑技术的研发。7月,Cell发表基于CHAMP(ChipHybridized Affinity Mapping Platform)基因测序技术平台的CRISPR编辑工具,其能够通过个体的完整基因组来快速检测CRISPR分子,从而预见除了CRISPR的靶点外其是否还能够同其它DNA片段相互作用,这种新方法或许就能够帮助临床医生为患者制定个体化的基因疗法,同时还能够保证疗法的安全性和有效性(DOI:10.1016/j.cell.2017.05.044)。

(3)精准多重基因编辑新工具eMAGE的提出

11月份,Cell发表耶鲁大学关于更加精确、高效的活体基因编辑技术,实现真核生物基因组的多个位点上进行精确的基因修饰。不同于现有基于DNA双链断裂和重新修复的基因编辑技术,通过对酵母的DNA复制和修复功能进行改造,就能够在不发生双链断裂的情形下将新的遗传信息插入到它的基因组的多个不同区域中,从而开发出真核生物多重基因组工程工具(DOI:10.1016/j.cell.2017.10.034)。

(4)基于CRISPR/Cas9工具的单条染色体敲除技术

8月,MolecularTherapy发表采用澳大利达亚特莱特大学关于CRISPR/Cas9对小鼠完整染色体的清除技术,在体外在41个位点切割Y染色体的着丝粒,可达到80%的Y染色体切割效率,在298个位点上切割Y染色体的长臂会导致95% Y染色体切割效率(DOI:10.1016/j.ymthe.2017.05.021)。

11月份,GenomeBiol发表我国上海生科院采用CRISPR/Cas9工具可选择性消除单条染色体敲除技术,介绍了CRISPR/Cas9技术的新型应用,即在细胞、胚胎或体内组织中,针对目标染色体进行多个DNA剪切,可以选择性消除单条染色体。通过证明应用CRISPR/Cas9介导的针对Y染色体的多位点DNA切割可以有效地将小鼠胚胎干细胞的Y染色消除。这种多位点剪切可通过单个sgRNA靶向结合多个特异的染色体位点,或者通过14个sgRNA分别结合各自的特异位点来达到(DOI:10.1186/s13059-017-1354-4)。

(5)可靶向RNA编辑的CRISPR/Cas13工具

2月,MolCell论文阐述靶向RNACRISPR酶系统,研究发现了两个利用Cas13b酶的新型的RNA靶向CRISPR系统,该酶系统具有靶向RNA的能力,可高通量地方式特异性地操纵RNA(DOI:10.1016/j.molcel.2016.12.023)。

6月,Cell发表中科院关于结构上揭示Cas13a切割RNA机制,通过解析来自口腔纤毛菌Cas13a结合crRNA和它的靶RNA时的晶体结构,以及LbuCas13a-crRNA复合物的冷冻电镜结构,证实 crRNA-靶RNA双链结合到LbuCas13a中的核酸酶叶的一种带正电荷的中心通道内,而且一旦结合靶RNA,LbuCas13a和crRNA经历显著的构象变化。这种crRNA-靶RNA双链形成促进LbuCas13a的HEPN1结构域移向HEPN2结构域,从而激活LbuCas13a的HEPN催化位点,随后LbuCas13a就以一种非特异性的方式切割单链靶RNA和其他的RNA。该发现揭示出VI型CRISPR-Cas系统的Cas13a抵抗RNA噬菌体的作用机制,这就为将它作为一种RNA操纵工具加以应用铺平道路(DOI:10.1016/j.cell.2017.06.050)。

9月,NatStruct Mol Biol论文展示RNA靶向CRISPR酶Cas13a的作用机制,描述了Cas13a酶如何产生功能性crRNAs,以及在靶标RNA识别之前,其催化活性如何被封闭,这将有助于解析细菌免疫系统,以及临床诊断治疗(DOI:10.1038/nsmb.3466)。

10月,Nature发表MIT关于CRISPR–Cas13靶向哺乳动物细胞中的RNA的基因编辑工具,证实切割RNA的Cas13a酶(之前称作C2c2)能够特异性地降低哺乳动物细胞中的内源性RNA和报告RNA水平,这是因为经证实它最为高效地切割它的RNA靶标,在人细胞系中,Cas13a仅靶向gRNA指定的RNA,而让细胞中测序的所有其他的RNA保持完整。研究指出Cas13a结合和切割单链RNA,并开发出可在哺乳动物细胞中发挥作用CRISPR-Cas13a的RNA编辑(DOI:10.1038/nature24049)。

二、基因编辑技术在生物医学研究中应用进展

1.人类基因编辑的技术监管

5月,JAMA发布美国科学院关于人类基因编辑的技术原则,从技术伦理的角度对该项新技术进行规范和监管建议。RNA引导CRISPR-Cas9基因组编辑系统在基因组编领域取得了重大突破,相比于早期的蛋白质引导技术,CRISPR-Cas9具有高效,低成本,操作简易等特点。科学的进步也引发了对于人类基因组编辑的担忧,例如如何平衡潜在利益与意外伤害风险、如何规范基因组编辑的使用、如何尊重个人、国家和文化的不同视角,这些是否影响技术使用。美国国家科学院报告提出对与人类基因组相关的专业设置、编辑监督与应用的建议:包括基础实验室研究、体细胞的临床应用、未来潜在的生殖细胞临床应用共3个方面。  

基础实验室研究  利用基因组编辑的基础研究促进对基因功能,早期人类的发展,干细胞,生殖生物学,基因与疾病之间的联系,以及癌症和其他疾病的理解。基因组编辑的基础研究是在伦理规范和监管框架下进行的,包括地方和国家监督委员会,以确保实验室的安全和保护捐赠组织和细胞研究的人的利益。报告认为,涉及体细胞和生殖细胞的基础研究对于科学和医学的进步是至关重要的,并建议在现有的监管结构下继续进行这项研究。  

用于治疗和预防疾病和残疾的体细胞编辑  基因治疗疾病的临床应用已经取得了长足的进步,但新的基因组编辑技术已经大大加快了基因治疗进展。例如,对化疗等常规治疗失败的癌症患者使用CRISPR-Cas9修改免疫细胞的临床试验已获得批准,体细胞基因组编辑在治疗遗传基础疾病,如镰状细胞贫血和免疫缺陷疾病中应用。  基因组编辑的临床应用可以在体内外进行。体外方法具有技术优势,因为基因编辑的细胞可以通过功能评估后再返回病人体内;体内编辑仍然存在技术上的挑战,如何实现有效的编辑和避免脱靶事件,这类试验已经在B型血友病患者中开展。  基因组编辑的临床应用包含于基因治疗下,受到自20世纪90年代以来道德规范的监督。通过进行仔细和适当的监督,基因治疗研究已获得广泛的公众支持。报告认为,在现有的监管框架下,在治疗或预防疾病或残疾方面,体细胞基因组编辑的临床试验应继续进行。  一个有争议的方面,基因组编辑关注其潜在的用途用于修改身体性状和获得超能力。例如,使用体细胞基因组编辑,以改善肌肉营养不良患者的肌肉组织将被视为恢复性治疗,而使用相同的方法,对没有相关病理个人应用将被视为"强化"。目前,这类应用的潜在风险较大并不应答被批准使用。未来其风险可能会减少,如何权衡好处与风险,将考验未来的决策制定者。

治疗或预防疾病或残疾的生殖细胞基因编辑 三分之一人类基因组编辑的潜在应用涉及改变生殖细胞,以防止严重的疾病或残疾。种系基因编辑已在动物上成功,但主要技术挑战仍然在开发技术的安全和可预见的人类使用方面。这项研究极具潜力,因为有数以千计的遗传疾病是由单个基因突变引起的。当没有其他合理的替代方案时,编辑生殖细胞可以减轻孩子的疾病负担,让准父母拥有基因相关的后代而无需将致病突变传播给他们的孩子。  由于生殖系编辑会导致可继承的遗传变化,对其安全提出了更大的关注,也有人认为,生殖系基因编辑跨越道德底线。鉴于这些技术和社会的关注,报告的结论是,对于任何生殖编辑行为应保持谨慎,但谨慎并不意味着禁止。该报告建议,生殖细胞编辑的临床试验可以允许,但只有经过更多的研究,以满足适当的风险/利益标准时才能授权这些试验。  

报告认为下列的遗传性的物种基因编辑可以被允许:①缺乏其他合理的选择②对令人信服地证明进行基因编辑可缓解严重疾病③只转化为在人群中普遍存在的基因变异,并且已知不存在副作用④风险和潜在的健康利益具备可靠的临床前和临床数据⑤临床试验中持续的严格的监督⑥长期多代后续综合计划⑦通过公众健康和社会福利和风险评估(DOI: 10.1001/jama.2017.4548)。

2.人体胚胎基因编辑的应用

人类胚胎基因编辑面临较多的技术不确定性和较大的伦理争议。当前仍处于科学探索和学术共同体探索的阶段。

科学研究

8月,Nature发表利用CRISPR/Cas9校正人胚胎中的致病性突变的研究,通过对活的人胚胎进行基因编辑,成功地校正导致心脏病的MYBPC3基因突变(DOI:10.1038/nature23305)。

11月,Protein& Cell发表中山大学利用改进的CRISPR-Cas9校正人胚胎中突变基因的研究,利用改进型CRISPR实现碱基编辑,这种基因组编辑方法要比传统的CRISPR-Cas9技术更加高效地校正点突变,成功地对导致β-地中海贫血的一种单核苷酸错误进行校正,尽管所产生的胚胎是嵌合的,也就是说,它们含有得到校正的细胞和未得到校正的细胞,但是这种技术比之前的方法有潜力实现更高精准的编辑(DOI:10.1007/s13238-017-0475-6)。

伦理探索

2月,人类基因编辑委员会就人类基因编辑的科学技术、伦理与监管开展全面研究,委员会发表了人类基因编辑的报告书,明确人类基因编辑研究的科学、伦理与监管基本原则,并提出了可遗传生殖系统基因编辑的10条规范标准。标准指出,可遗传生殖系统基因编辑只有在缺乏其他可行治疗办法时使用;仅限于预防某种严重疾病;仅限于编辑已经被证实会致病或强烈影响疾病的基因等。

10月,CellStem Cell发表联合署名的论述文章,综述了科学界对人类基因编辑尤其是可遗传的胚胎基因编辑发展的详细指导意见,同时阐述了人类胚胎基因编辑对于胚胎发育等基础研究的重要推动作用,以及国际学术合作对潜在临床应用的重要意义。并提出人类胚胎基因编辑技术可以有效推动人类胚胎发育学的研究,倡议对于人类胚胎研究的限制进一步合理放开,科学界将能够取得更大的成果,这些理解可能在未来几年对世界范围内的人类胚胎基因编辑研究提供新的思路和研究基础,并且提出通过国际合作推动人类胚胎基因编辑中所存在诸多问题的解决(DOI:10.1016/j.stem.2017.09.010)。

3.基因编辑技术用于遗传筛查

2月份,Nature Method论文指出,采用基因编辑技术与测序技术相集合,可高效用于遗传筛查。采用CRISPR-Cas9系统在单个样品中平行生成数千个基因扰动,之后利用单细胞RNA-Seq,同时测定每个细胞的扰动和表型。该方法可以将丰富的表型信息与每个特定扰动相关联,实现了大规模的单细胞转录谱分析,结合了混合筛查与芯片筛查的主要优点,从而有助于我们更有效地探索新颖的生物学机制。采用CRISPR液滴测序(CROP-seq)可有效结合四大关键要素向导RNA载体、高通量的单细胞RNA-seq检测、配单细胞转录组的计算管道以及分析和解释向导RNA诱导的转录图谱的生物信息学方法。CROP-seq的优势在于能直接读取向导RNA,这大大简化了单细胞CRISPR筛查,使其与混合筛查中的标准克隆方案完全兼容。该方法是一种通用型检测法,可在不依赖生物标记的情况下捕获各类表型,有望直接用于大数量细胞的活检样本(doi: 10.1038/nmeth.4196. doi: 10.1038/nmeth.4177)。

4.基因编辑技术用于干细胞编辑

7月,Cell Res发表中科院关于单碱基基因编辑干细胞进行可遗传功能增强研究,利用基因编辑技术改写了人类基因组遗传密码中NRF2编码基因第2号外显子上的单个碱基,首次在实验室中获得了遗传增强的“超级”干细胞(Genetically Enhanced Stem cells,GES细胞)。这种GES细胞具有对细胞衰老和致瘤性转化的双重抵抗作用,因此为开展安全有效的干细胞治疗提供了可能的解决方案(DOI:10.1038/cr.2017.86)。

5.基因编辑技术用于模式动物的研究

  5月,Cell发表利用TALEN基因编辑技术构建食蟹猴Rett综合征神经发育性疾病模式动物,可为相关疾病的研究提供重要的动物模型(DOI: 10.1016/j.cell.2017.04.035)。

6.基因编辑技术用于T细胞治疗

TALEN基因编辑技术用于通用型CART细胞的制备。3月份,美国辉瑞(Pfizer)与法国施维雅(Servier)和Cellectis近日联合宣布,CAR-T细胞疗法UCART19的实验性新药申请(IND)已获得了美国食品和药物管理局(FDA)的批准,可以在美国开展人体临床试验,用于复发性/难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗。UCART19是一种同种异体CAR-T细胞疗法,利用Cellectis公司专有的同种异体方法开发而成,这种方法基于TALEN基因编辑技术,不需要依据患者进行相应修饰,而是直接将来源于非患者供体的T细胞进行工程化,用于多个患者的治疗,该技术有无可比拟的优势。但9月份Cellectis另一款通用型CAR-T临床试验UCART123的两项1期临床试验中,一名患者因治疗引起的严重毒性反应导致死亡,FDA因此对两项试验叫停,通用型CART研究面临挑战。

CRISPR/Cas9基因编辑技术用于抗癌T细胞的改造。3月份,Nature发表斯隆凯特林癌症纪念中心利用CRISPR/Cas9构建强效CAR-T细胞的研究论文,证实CRISPR/Cas9技术能够运送CAR基因到T细胞基因组中的特定位点上。这种精准的方法能够更强健地构建出CAR-T细胞,能够持续更长的时间地杀死肿瘤细胞(DOI:10.1038/nature21405)。11月份,Blood发表英国卡迪夫大学关于利用CRISPR/Cas9替换T细胞受体产生优异的抗癌T细胞的研究,采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对杀伤性T细胞进行进一步基因改造,将非癌症特异性受体替换为特异性癌细胞的受体,从而实现肿瘤的T细胞治疗效果(DOI:10.1182/blood-2017-05-787598)。

7.基因编辑技术用于药物靶点筛选

7月,Nature发表利用体内CRISPR-Cas9筛选技术发现新的药物靶标来增强癌症免疫疗法论文,利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术在小鼠体内测试上千个肿瘤基因的功能。利用这种方法揭示出新的药物靶标,从而可能潜在地改进PD-1检查点抑制剂的疗效(DOI:10.1038/nature23270)。

11月份,Nature论文指出CRISPR-Cas9技术可高效用于AML白血病的新药物靶标的鉴定出,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术筛选人AML细胞中可加以靶向的基因发生突变的小鼠白血病细胞,并且系统性地测试每个基因,以便发现哪些基因是AML细胞存活所必需的基因位点,从而作为新药靶点(DOI:10.1038/nature24678)。

8.基因编辑技术用于癌基因筛选

10月份,NatGenet论文提出用于校正CRISPR癌症基因筛选中假阳性的方法(CERES)。研究将342种癌细胞系的基于CRISPR的数据添加到他们不断增加的癌症基因依赖性目录中,CERES的计算方法可有效限制筛查中的假阳性结果,可对汇集的CRISPR筛选数据进行拷贝数效应校正,并且针对癌细胞的基因依赖性提供给一种客观的观点(DOI:10.1038/ng.3984)。

9.基因编辑技术用于RNA检测,推动诊断技术的发展

4月,Science发表基于CRISPR/Cas13a基因编辑技术的的诊断平台,可检测任何RNA分子,灵敏度增加一百万倍。该技术是将一种靶向RNA(的CRISPR相关酶(Cas13a)改造为一种快速的、廉价的和高度灵敏的诊断工具,用作一种高度灵敏的检测器——能够指示最少至一个靶RNA或DNA分子的存在,该技术可用来应对病毒性和细菌性流行病爆发、监控抗生素耐药性和检测癌症(DOI:10.1126/science.aam9321)。

5月,MolCell发表加利福尼亚大学的关于可用于诊断的10种CRISPR酶(Cas13a突变体)的论文,指出新型Cas13a突变体能够在腺嘌呤位点切割RNA,这种差异性就能够实现同时检测两种不同的RNA分子,比如来自两种不同病毒的RNA。研究发现了10个Cas13a样蛋白具有不同程度的RNA切割能力(DOI:10.1016/j.molcel.2017.04.008)。

三、基因编辑在疾病基因治疗中的进展

基因治疗是基于对细胞内基因修饰的策略来治疗各种疾病。单基因疾病是由于碱基突变引起,可通过恢复基因的表达水平实现疾病的治疗;而多基因疾病的治疗相对来说比较困难。传统的基因治疗手段通过正常基因的导入弥补缺陷基因,但是基因导入的效率又是一个难题。随着病毒载体的发展和应用,研究人员试图通过病毒载体介导基因导入用以对疾病的基因治疗。其中逆转录病毒介导的基因治疗首先进入临床,之后慢病毒(lentiviruses)、腺病毒(adenoviruses)、腺相关病毒(adeno-associated viruses, AAVs) 等也在基因治疗临床中予以试验。虽然,诸如逆转录病毒一类的治疗载体可以将所需目的基因整合到基因组中,持久表达用以代替缺陷基因,但是,逆转录病毒的整合具有随机性,倘若引起原癌基因的激活引发癌症,那么它的安全性将受到质疑。寻找特异、高效修复的打靶工具在基因治疗领域中备受关注。

基因编辑技术的出现和应用为人类疾病的治疗提供有力的手段。主要途径是包括体外编辑回输体内和体内编辑两类。近年来ZFNs、TALENs 和CRISPR/Cas9 系统在遗传性疾病、传染性疾病和癌症方面取得许多较多的进展,并推动了基因治疗领域发展的步伐。与传统基因治疗方法相比,基因编辑技术能在基因组水平上对DNA序列进行改造,从而修复遗传缺陷或者改变细胞功能,使得彻底治愈白血病、艾滋病和血友病等恶性疾病成为可能。基于锌指核酸酶(ZFN)基因编辑技术具有较高的精度,几类产品已经进入临床阶段。CRISPR/Cas9基因编辑技术对特定基因组DNA的定位也逐渐更加精准,成本更加低廉,正在成为基础研究和临床应用的主流技术。

1.基因编辑已进入人体临床试验阶段

之前基因编辑的相关疾病治疗的研究均在细胞和动物体内展开,相关的人体临床试验尚未广泛开展。5月份,Sangamo 治疗公司(Sangamo Therapeutics,以下称 Sangamo)招募参与者参加基因编辑的几项临床试验:血友病 B、赫勒综合征(Hurler syndrome)或亨特综合征(Hunter syndrome)患者,临床试验将通过腺相关病毒(AAV)为载体的锌指核酸酶(ZFN)在他们的基因组上产生双链 DNA 断裂,将编码功能性酶的基因插入到他们的基因组上,从而进行治疗。  在所有的这三项临床试验中,ZFN 在人肝细胞中的白蛋白编码基因的靶位点上进行切割,随后这种基因的一种功能性拷贝通过同源重组而被整合到肝细胞的基因组中。

11月份,Sangamo公司报道完成了针对亨特氏综合征的1例人体体内基因编辑治疗临床试验,使用病毒为载体的ZFN基因编辑工具对于肝细胞特定基因进行修复编辑,治疗效果有待进一步观察。

2.基因编辑用于单基因遗传病治疗

1月份,ScienceTranslational Medicine发表美国NIAID论文,采用CRISPR-Cas9基因编辑技术通过体外靶向和修复源自X连锁慢性肉芽肿病(X-linked chronic granulomatous disease)患者体造血干细胞中的缺陷基因(CYBB),并将编辑后造血干细胞移植至体内实现这些经过修复的造血干细胞产生了功能正常的白细胞(DOI: 10.1126/scitranslmed.aah3480)。

4月份,ScienceAdvances德州大学论文,使用CRISPR-Cpf1(Cpf1比Cas9酶小很多,这就使之更容易包装到病毒内,因此也更加容易进入肌细胞)基因编辑系统,在人类心肌细胞和动物模型中实现了杜氏肌营养不良突破基因的靶向和修复,可以有效治疗此类疾病(DOI: 10.1126/sciadv.1602814)。

6月,JCI论文展示CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗亨廷顿舞蹈症的动物试验证据,在亨丁顿舞蹈症模式小鼠中利用通过病毒载体运送的CRISPR/Cas9切除它们的脑细胞中的mHTT基因的一部分,使得亨廷顿蛋白聚集物几乎消失了(DOI:10.1172/JCI92087)。

3.基因编辑与眼科疾病治疗

基因编辑可有效用于治疗视网膜疾病。2月份,Nature Communications 发表韩国Institute for Basic Science动物实验研究证据,采用用工程技术开发出了迄今最小的CRISPR-Cas9,并通过腺相关病毒(AAV)运载到小鼠的肌细胞和眼部,用以修饰引起失明的基因(Vegfa或Hif1a)。研究结果显示通过AAV运载到视网膜的CjCas9能够有效抑制小鼠Hif1a和VEGF A基因的激活,减少脉络膜新血管形成的面积,眼内注射AAV包装的CRISPR-CjCas9还可以用于治疗其他视网膜疾病和系统性疾病。CjCas9具有高度特异性不会脱靶引起基因组产生其他突变(DOI: 10.1038/ncomms14500)。

3月份,NatureCommunications美国国立健康研究院动物实验研究证据,采用腺病毒为载体的CRISPR/Cas9基因编辑系统,靶向敲除视网膜细胞Nrl基因,可有效缓解色素性视网膜炎视网膜退化(DOI: 10.1038/ncomms14716)。同月,Genome Res发表采用CRISPR-Cas9编辑技术组织视网膜疾病,将CRISPR-Cas9复合物注射到湿性黄斑变性模式小鼠的眼睛中,对VEGF基因进行局部修饰,结果显示运送预组装的CRISPR-Cas9复合物要比利用质粒运送相同的组分更加高效,仅修饰VEGF基因,而不影响其他的基因,有效控制了网膜和巩膜之间形成新的血管的生成(DOI:10.1101/gr.219089.116)。

7月,NatCommun发表MIT关于利用CRISPR-Cas9阻止视网膜中的血管生成治疗多种眼部疾病论文,利用腺相关病毒(AAV)运送靶向VEGFR2基因的CRISPR-Cas9系统,成功地阻止视网膜中的血管生成(DOI:10.1038/s41467-017-00140-3)。

10月,PNAS刊载爱荷华大学关于利用“CRISPR-Cas9”技术治疗青光眼的动物实验研究,并且利用CRISPR/CAS9技术将突变的肌纤蛋白进行了敲除,而肌纤蛋白的突变是引发广角青光眼的主要因素(DOI:10.1073/pnas.1706193114)。

4.基因编辑用于艾滋病治疗

3月份,Molecular Therapy发表美国天普大学动物实验研究证据,在人源化小鼠HIV模型上证明多靶点/saCas9的腺病毒载体AAV-DJ8基因疗法能有效剔除多个器官组织中的人类HIV潜伏感染病毒,从而为人类潜伏HIV的治疗提供重要方法路径(DOI: 10.1016/j.ymthe.2017.03.012)。

. 8月,MolecularTherapy发表通过CRISPR/Cas9靶向CCR5基因次产生突变,并在体内产生HIV抵抗力的动物实验研究,在人胎儿肝脏造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell, HSPC)中让CCR5基因发生突变,并且证实在移植到小鼠体内后,这些HSPC细胞能够阻断HIV感染(DOI:10.1016/j.ymthe.2017.04.027)。

5.基因编辑用于肿瘤治疗

5月份,NatureBiotechnology发表匹兹堡大学研究,利用病毒递送CRISPR/Cas9基因编辑工靶向敲除融合基因的突变DNA序列,并用导致癌细胞死亡的基因来替代编辑敲除部位,从而导致癌细胞死亡。由于融合基因只存在于癌细胞,不存在于健康细胞中,因此这类新型基因疗法特异性非常高(DOI: 10.1038/nbt.3843)。

6.基因编辑助力免疫治疗

2月份,Nature发表纪念斯隆—凯特琳癌症中心的论文,不同于当前主流采用逆转录病毒或慢病毒将CAR基因传递到T细胞的基因组内的CAR-T细胞构建方法(该方法导致CAR基因会被随机插入到受体细胞的基因组中,从而引发潜在的遗传副作用),采用CRISPR-Cas9技术可以构建了更有效的CAR-T细胞,并在小鼠中增强了肿瘤抑制作用(DOI: 10.1126/scitranslmed.aah3480)。

7.基因编辑用于血液病的治疗

8月,Blood发表利用CRISPR引入有益的血红蛋白突变基因,可治疗危及生命的血液疾病,利用基因编辑技术CRISPR将一种有益的自然突变(British-198)引入到血细胞中,能够开启胎儿血红蛋白(foetal haemoglobin)产生,这一进展可能最终导致人们开发出治愈镰状细胞性贫血和其他的血液疾病的方法(DOI: 10.1182/blood-2017-02-767400)。

回首再等待 发表于 2018-6-21 17:42   显示全部楼层
楼主,这是您写的吗?
小院静思 发表于 2018-6-21 17:42   显示全部楼层
谢谢您的分享!以后多多分享一些这样的内容。
qiange_dzl 发表于 2018-6-21 17:42   显示全部楼层
这篇文章不错,我可以收藏吗,楼主大人
mayelu 发表于 2018-6-21 17:42   显示全部楼层
好东西一定要看看!
fengqiaowei 发表于 2018-6-21 17:43   显示全部楼层
这篇文章不错,我可以收藏吗,楼主大人
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